1.0) Introdução
Uma das ferramentas mais importantes para o estudo das doenças é a análise histológica de tecidos. Podemos analisar desde minúsculas biópsias teciduais até produtos de ressecções cirúrgicas complexas de múltiplos orgãos. Entretanto, para que uma amostra tecidual retirada de um paciente seja examinada sob o microscópio, ela precisa passar por uma série de etapas. Em linhas gerais essas etapas são:
fixação
processamento histológico e microtomia
coloração histológica
A primeira etapa, que ocorre idealmente assim que a amostra é retirada do paciente, é a fixação histológica. E é por ela que iniciarei esse sequência de textos e vídeos que procurará explorar como funcionam as técnicas histológicas, o contexto histórico dos principais avanços metodológicos e a relação temporal/ geográfica com o desenvolvimento de uma das teorias mais importantes da medicina: a teoria celular das doenças.
Fixação é uma série de eventos químicos e físicos que objetiva proteger os tecidos dos efeitos da autólise e putrefação, que ocorrem assim que as amostras são retiradas do organismo- e a qualidade da fixação é essencial para uma análise diagnóstica adequada.
Os principais objetivos da fixação são:
prevenir autólise tecidual e putrefação
endurecer a amostra, facilitando as demais etapas do processamento
manter as características teciduais (ie, morfologia- forma, volume, cor) as mais próximas do estado natural
preservar os componentes moleculares do tecido, isto é, proteínas, ácidos nucléicos, lipídios e carboidratos
evitar crescimento bacteriano nos tecidos
É importante notar que não existe fixador ideal. A escolha de um tipo particular de fixador inevitavelmente está associada a ganhos e perdas- uma vez que o mecanismo de preservação tecidual de determinado fixador também implica na criação de artefatos específicos a cada substância.
2.0) Quais são os tipos diferentes de fixação?
Há inúmeras maneiras pelas quais podemos classificar os diferentes meios de fixar tecidos. As duas principais são em relação à natureza da fixação e propriedades químicas dos fixadores
Natureza da fixação:
Fixação por imersão: a mais comum! Nessa técnicas imergimos a amostra em uma solução fixadora líquida, p.ex. a formalina.
Fixação por revestimento: usada em técnicas citológicas, em especial nas amostras coradas pelo método de Papanicolaou; borrifa-se a amostra com solução alcóolica
Fixação por perfusão: nesse método injeta-se no sistema arterial do animal ou órgão solução fixadora; usada primariamente em pesquisa.
Fixação por liofilização ("Freeze-drying"ou criodessecação): corta-se o material em fatias finas e congela-os rapidamente. Na sequência, remove-se o gelo com auxílio de vácuo. Método de pesquisa, bom para análise de proteínas, enzimas e glicogênio.
Fixação por microondas: utiliza-se o microondas, em geral, para otimizar a fixação química com outros agentes, como o formalideído.
Fixação por calor: exemplo clássico é cozinhar um ovo; o calor desnatura as proteínas e as fixa.
Propriedades químicas dos fixadores:
aldeídos: fixação por ligação cruzada com proteínas; exemplos: formaldeído, glutaraldeído
agentes oxidantes: fixação por ligação cruzada com proteínas; exemplos: tetróxido de ósmio
fixadores baseados em álcool: fixa por desnaturação das proteínas através de desidratação
miscelânea: ácido pícrico
3.0) Como os fixadores funcionam?
Podemos entender a fixação como um processo que leva a morte celular rápida, evitando a ação danosa de enzimas autolíticas e crescimento de microorganismos. Central ao processo de fixação é a interação entre o fixador e as proteínas celulares.
Proteínas e fixadores
A principal reação química da fixação tecidual é a estabilização das proteínas. As proteínas são moléculas altamente complexas cujas funções dependem não apenas da sequência de aminoácidos que as compõem, como também o formato tridimensional que elas assumem.
A estabilização das proteínas ocorre através da desnaturação. Diz-se que uma proteína é desnaturada quando sua estrutura secundária, terciária ou quartenária é perdida. Entre os fatores que causam desnaturação temos elevação da temperatura, extremos de pH, solventes orgânicos (etanol p. ex.), exposição à detergentes. Um exemplo clássico de desnaturação protéica é cozinhar o ovo- o calor modifica irreversivelmente a albumina, principal constituínte da clara.
As principais maneiras pelas quais os fixadores desnaturam as proteínas são:
desidratação: ao remover a água livre dos tecidos, o fixador quebra o equilíbrio entre as interações das áreas hidrofílicas e hidrofóbicas, rompendo as estruturas secundárias e terciárias das proteínas. Os principais fixadores por desidratação são os álcoois (etanol, metanol) e a acetona.
através da formação de ligações cruzadas/ adições covalentes: a alteração das estruturas secundárias, terciárias e quartenárias das proteínas ocorre através da formação de ligações covalentes ou ligações cruzadas entre as moléculas dos fixadores e as proteínas. Os principais exemplos são o formaldeído e o glutaraldeído.
Ao desnaturar as proteínas, os fixadores levam a:
desativação das enzimas proteolíticas
morte de microorganismos associados à putrefação
aumento da estabilidade e força das moléculas, preservando morfologia e endurecendo os tecidos
Um dos grandes problemas da desnaturação protéica é a dificuldade, se não impossibilidade dependendo da situação, em recuperar a estrutura tridimensional inicial das mesmas. Ao se alterar a estrutura tridimensional das proteínas, dificulta-se a interação com eventuais anticorpos dirigidos aos epitopos específicos daquela proteína. E é justamente essa ligação que é explorada na técnica de imuno-histoquímica. Para contornar tal situação desenvolveram-se métodos de recuperar antígenos- melhorando muito a realização da reação imuno-histoquímica em amostras fixadas por formalina, por exemplo.
Quais fatores interferem no processo de fixação?
pH do fixador: o pH neutro é preferível; extremos de pH interferem com a fixação
temperatura: temperaturas mais altas facilitam a fixação; entretanto, a temperatura ambiente é adequada para a rotina.
duração da fixação: depende do tipo de fixador- para a formalina a fixação ideal ocorre entre 6 e 72h, dependendo do tamanho da amostra.
osmolaridade da solução fixadora: soluções levemente hipertônicas geralmente fixam melhor
concentração: exemplo- formalina com concentrações maiores que 10% tendem a aumentar o encolhimento e endurecimento das amostras- além de aumentar a formação de depósitos de formalina
agitação
4.0) Qual a história do uso de fixadores?
Quando pensamos na história das técnicas artificiais de preservação dos tecidos, independente do motivo, o antigo Egito logo vem a mente. Acredita-se que a prática de mumificar os mortos surgiu ao redor do ano 3500 AC. Provavelmente a idéia de se preservar corpos surgiu da observação de como alguns cadáveres naturalmente “mumificavam" nas areias quentes do Egito. A palavra múmia deriva do latim mumia que, por sua vez, derivava da palavra persa mum, que significava “cera”- uma vez que os corpos mumificados pareciam ser revestidos de cera. Curiosamente, a etapa posterior da fixação, na análise histológica, objetiva incluir o tecido em cera de parafina.
Um dos pioneiros na preservação tecidual foi Marcello Malpighi- conhecido como um dos fundadores da histologia, e nome facilmente reconhecível para os estudantes da disciplina. Em 1666, para melhor estudar a estrutura renal, ferveu o órgão na tentativa de o preservar. Outro marco na fixação tecidual foi a utilização de soluções alcóolicas. Há um certo conflito na literatura sobre quem foi a primeira pessoa a usar álcool para preservar tecidos. De qualquer maneira, a utilização de soluções alcoólicas para preservar tecidos e espécimes marinhos foi utilizada tão remotamente quanto em 1663 por Robert Boyle e 1743 por Baker. Controvérsias históricas a parte, podemos concluir que a grande primeira substância fixadora foi o álcool.
Entretanto, o grande salto no desenvolvimento e utilização de fixadores aconteceria partir da segunda metade do século XIX e início do século XX. É possível argumentar, inclusive, que o conceito moderno de fixação tecidual tenha surgido em 1833, quando Jacobsen usou ácido crômico como “agente endurecedor”- motivo pelo qual a palavra fixação foi escolhida.
É no século XIX que grande parte dos fixadores mais famosos foram desenvolvidos:
Colocando o desenvolvimento dos fixadores no contexto das principais descobertas da medicina temos o seguinte panorama:
História do uso do formaldeído como fixador tecidual
O formaldeído foi descoberto em 1859 por Aleksandr Butlerov, ao perceber o odor característico da molécula, enquanto tentava sintetizar metileno glicol. Entretanto, passaram-se cerca de 10 anos até que a solução aquosa de formaldeído (formalina) tivesse sido produzida, por August Wilhelm von Hofmann (1867). O processo de produção em escala industrial foi patenteada em 1889- e a produção comercial então pode começar. O primeiro país a produzir formaldeído em escala industrial foi a Alemanha.
A primeira vez que alguém faz referência formal ao uso do formaldeído para preservar materiais biológico ocorreu em 1892. Nessa ocasião, o químico francês Auguste Trillat patenteou na França um método para produção de formaldeído como anti-séptico- e especulou sobre o uso da substância para fixar carne, plantas e cadáveres. Entretanto, o título de “pai" do uso do formaldeído como fixador tecidual cabe ao médico alemão Ferdinand Blum, em 1893.
O Dr Blum, curiosamente, não era patologista. Sua história profissional cruza com o formaldeído quando uma companhia química alemã (Meister, Lucius e Brüning- que eventualmente tornaria-se a empresa Hoechst- hoje um braço da Sanofi-Aventis, após inúmeras fusões), o contrata para testar as capacidades anti-sépticas do formaldeído. Foi o Dr Blum que percebeu que a diluição de formalina a 10% (formaldeído 4%) tinha não apenas uma boa ação lenta germicida, mas como tornava a ponta dos dedos de quem utilizava a solução endurecida- algo, aliás, muito bem conhecido para os que diariamente trabalham como amostras fixadas em formalina. Essa rigidez era a mesma observada quando se fixava amostras em álcool. Baseada nessa experiência, passou-se a utilizar, até hoje, a formalina como solução fixadora- inclusive com a mesma diluição 1:9.
Essas observações foram publicadas em dois artigos- o primeiro em que ele descrevia as propriedades bactericidas da solução de formalina a 10%. Porém, o segundo artigo, originado de uma observação acidental, que demonstrava as capacidades fixadoras do formaldeído, é que acabou abrindo as portas para o uso mais amplo da substância na medicina.
Primeiro artigo: O formaldeído como anti-séptico
Blum F: Der formaldehyd als antisepticum. Munch Med Wochenschr
8 Aug 601, 1893.
Segundo artigo: O formaldéido como agente de endurecimento.
Blum F; Der formaldehyd als hartungsmittel. Z Wiss. Mikrosc
10:314, 1983.
E aqui cabe um pequeno contexto histórico da confusão dos termos formaldeído, formalina e formol. Como vimos, o nome da substância química é formaldeído. Entretanto, as primeiras indústrias alemãs batizaram a mesma solução aquosa com nomes comerciais diferentes; a Meister, Lucius e Brunig de formol, enquanto a Chemischen Fabrik auf Actien (que originou a Schering) de formalina. Na época muitos, incluíndo o Dr Blum, argumentavam que o nome correto para abreviação de formaldeído deveria ser formal- e não formol- e que a palavra formalina não tinha significado. Outra curiosidade história justifica o motivo de algumas pessoas se referirem à concentração do formaldeído na solução de formalina à 10% como sendo de 3,7 ou 4,0%. Na verdade, ambas as concentrações se referem à diluição de 100mL de formaldeído e 900mL de água. Porém, as soluções aquosas de formaldeído eram tanto medidas como em porcentagem em relação ou ao peso (100 gramas de solução) ou ao volume (100 cc)- o que justificaria a diferença entre 3,7 e 4,0 muitas vezes relatadas para a mesma diluição.
Uma breve biografia de Dr Ferdinand Blum:
nasceu em Frankfurt, Alemanha, em 3 de outubro de 1865
graduado em medicina pela universidade de Freiburg
ao retornar para Frankfurt, começou o projeto com Meister, Lucius e Brunig
após os trabalhos com formaldeído, teve carreira brilhante em medicina experimental
trabalhou no então novo Instituto Paul Ehrlich- hoje o Instituto para Biologia Experimental Ferdinand Blum é parte do Consórcio Paul Ehrilch de Frankfurt
Mudou para a Suiça durante a segunda guerra mundial, mas voltou para Frankfurt, onde morreu aos 94 anos
5.0) Formaldeído
Sem sombra de dúvidas, o tipo de fixador mais utilizado nos laboratórios de anatomia patológica pelo mundo é o formaldeído. Porém, como mencionado anteriormente, precisamos tentar esclarecer algumas dúvidas sobre a terminologia. É muito comum ouvirmos as palavras “formalina”, “formol" e “formaldeído" serem usadas de maneira intercambiável nos laboratórios. Vimos que uma parte da confusão ser originou na nomenclatura comercial dada pelas indústrias químicas no século XIX . Porém, qual a diferença entre elas, então?
Aldeídos, formaldeído, formol e formalina …
Aldeídos representam um conjunto de compostos da química orgânica que tem em comum em sua estrutura o grupamento carbonila (C=O). Esse grupamento carbonila se liga a um átomo de hidrogênio e um grupo R.
R refere-se a uma cadeia lateral que se liga à estrutura central da molécula. Chamamos o conjunto do grupamento carbonila ao hidrogênio (isto é, a estrutura sem o grupo R) de grupo formil. Curiosamente, formil deriva da palavra latina “formica" (formiga).
O formaldeído é o aldeído mais simples. Nele, o grupo R é um átomo de hidrogênio.
O formaldeído, também conhecido como metanal, pode ser encontrado em diversas formas. O formaldeído puro ocorre na forma gasosa. Em solução aquosa, o formaldeído reage com a água e forma o metanodiol (metileno glicol). A solução aquosa de formaldeído diluído a 40% é conhecido como formol ou formalina. A apresentação mais comumente usada é a “Formalina a 10%”- que no final das contas representa uma concentração de 4% de formaldeído em solução aquosa.
Observações práticas:
. Em alguns livros e artigos, refere-se a formol como formaldeído a 40% e formalina como solução de formol a 10%. Porém a nomenclatura mais aceita é a que equipara formol e formalina. Como vimos, boa parte dessa confusão vem da origem histórica dos nomes comerciais dados no século XIX.
. Eventualmente uma solução de formalina, em virtude de armazenamento prolongado, pode precipitar na forma de uma substânica branca. Esse pó branco é formado por paraformaldeído.
. A solução aquosa de formalina a 10% tem, além de formaldeído e água, metanol. Isso ocorre pois, uma vez que o formaldeído polimeriza rapidamente em solução aquosa, há aumento do peso molecular do composto, o que dificulta a penetração nos tecidos. O metanol é acrescido na solução justamente para evitar essa polimerização excessiva. (formalina 10% é 3,7% formaldeido em água e 1% metanol)
. Hoje em dia recomenda-se o uso de formalina neutra tamponada a 10%, utilizando-a com os seguintes cuidados para uma melhor preservação da morfologia/ antigenicidade e ácidos nucléicos:
volume do fixador deve ser pelo menos 10 vezes maior que o volume do espécime
não deixar os espécimes “apertados” nos recipientes
fixação mínima de 6h e no máximo 72h
espécimes devem ser imersos logo após retirada ou, no máximo, até 1h hora após
Como o formaldeído fixa os tecidos?
O fundamento químico que permite o formaldeído fixar tecidos é sua capacidade em fazer ligações com as proteínas. Ao se ligar às proteínas, o formaldeído estabiliza a estrutura dessas moléculas e reduz a atividade das enzimas autolíticas. A interação entre as moléculas de formaldeído e as proteínas ocorre em duas etapas:
Primeira etapa: demora entre 24 e 48h para ocorrer, e tem natureza reversível. Nessa fase há a ligação covalente entre as moléculas de formaldeído com as cadeias laterais proteícas, resultando na adição de grupos hidroximetil nas cadeias laterais das proteínas. Podemos desfazer essas ligações com lavagem prolongada das amostras em água. Além disso, essa reversibilidade pode ser explorada através de técnicas de recuperação de antígeno- que permitiram um salto de qualidade na análise imuno-histoquímica das amostras fixadas.
Segunda etapa: ocorre progressivamente na sequência e até cerca de 30 dias após o início da fixação. Nessa fase há a formação de ligações irreversíveis com as proteínas, na forma de pontes de metileno. A principal consequência da irreversibilidade desse processo é a progressiva redução da recuperação de antígenos e ácidos nucléicos em amostras fixadas por tempo prolongado.
Logo, para fixar os tecidos, o formaldeído precisa primeiro os penetrar em toda profundidade e, então, iniciar a formação das ligações com as proteínas. A profundidade de fixação é diretamente proporcional à raiz quadrada do tempo de fixação. Como regra geral, a taxa de penetração da formalina é de 1mm/ hora. Dessa maneira, tecidos pequenos em geral requerem ao menos 6 horas para fixação adequada, enquanto que tecidos maiores precisam de ao menos 24h. Vale lembrar que não se deve ultrapassar as 72h de fixação em formalina- quando há o início de ligações irreversíveis que prejudicam a recuperação de antígenos.
Artefatos em decorrência do uso de formaldeído.
Artefatos são consequências indesejáveis e que podem atrapalhar a análise histológica. Ocorrem nos extremos do uso; isto é, por uso insuficiente ou excessivo de formaldeído. O artefato mais óbvio é o decorrente do uso insuficiente de formaldeído. Nessa situação, há autólise tecidual, com perda da arquitetura histológica e molecular. Ao exame microscópico uma das consequências é a presença de margens nucleares pouco delimitadas, com núcleos de aspecto algodonoso e com bolhas.
(Autólise- Fonte da imagem: Artifacts in Histologica and Cytological Preparatations. Rolls GO e colaboradores)
Um artefato que ocorre com o uso prolongado, em especial de soluções não tamponadas, é a deposição de pigmento de formalina. O ácido fórmico, substância derivada da oxidação do formaldeído, reage com derivados de hemoglobina sanguínea, formando um pigmento enegrecido/ acastanhado, refrátil e birrefringente. É possível remover o pigmento, processando as amostras em xileno, álcool e água na sequência.
(Pigmento de formalina- Fonte da imagem: https://www.facebook.com/PathologyDiscussionForum/photos/formalin-pigmenta-formalin-fixed-paraffin-section-of-kidney-showing-the-typical-/1124998687610416/)
Um artefato molecular importante é a perda da antigenicidade tecidual. Em outras palavras, quanto maior o tempo que uma amostra passa em formalina (mais de 72h), menos reversíveis se tornam as ligações entre formaldeído e proteínas, tornando a recuperação dos antígenos protéicos cada vez mais difícil. Logo, quando realizamos estudo imuno-histoquímico nessas amostras, é maior a chance dos anticorpos não detectarem os antígenos teciduais- e, consequentemente, maiores as chances de falsos negativos na reação imuno-histoquímica.
Clinicamente, um dos maiores exemplos dessa consequência negativa do tempo excessivo de fixação em formalina, é o aumento de resultados falso negativos/ inconclusivos nas análises imuno-histoquímicas de receptores de estrógeno, progesterona e HER-2 em carcinomas mamários. Uma vez que o tratamento das pacientes com câncer de mama depende diretamente da avaliação dessas proteínas, pacientes com resultados falso-negativos podem deixar de receber tratamento adequado. E tudo isso por um erro de fixação de suas amostras de biópsia/ ressecção cirúrgica.
(HER-2 positivo (Escore 3+) através de estudo imuno-histoquímico)
RESUMINDO!
Fixar é impedir autólise e endurecer tecidos, permitindo a análise histológica
Há inúmeras maneiras de se fixar tecidos. A mais comumente utilizada é a fixação química por imersão em solução aquosa de formaldeído (conhecida como formol ou formalina)
O formaldeído fixa através da ligação com proteínas teciduais. Isso estabiliza as proteínas, impedindo a ação de enzimas autolíticas e matando os microorganismos contaminantes.
O tempo adequado de fixação em formalina depende do tamanho da amostra. Em geral não pode ser menor que 6 horas ou ultrapassar 72h.
Fixação inadequada pode causar desde falsos negativos em análises imuno-histoquimicas até impossibilitar o diagnóstico histológico.
Referências:
Livros:
Artifacts in Histological and Cytological Preparations. Rolls GO, Farmer NJ and Hall JB. Scientia- Leica Microsystems’Education Series.
Manual of histological techniques. Santosh Kumar Mondal. 1st ed. 2017. Jaypee Brothers Medical Publishers.
Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques, 8th edition, 2018. Edited by John D Bancroft, S Kim Suvarna and Chirstopher Layton. Elsevier.
Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice. J. A. Kiernan. 5th ed. 2015. Scion Publishing.
Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Pranab Dey. 1st ed. 2018. Springer.
Fluid Preservation: A Comprehensive Reference. John E. Simmons. 1st ed. 2014. Rowman & Littlefield Publishers.
Manual de Boas Práticas em Patologia. Emilio Assis. São Paulo: Sociedade Brasileira de Patologia, 2020.
Artigos científicos:
Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Thavarajah R, Mudimbaimannar VK, Elizabeth J, Rao UK and Ranganathan K .J Oral Maxillofac Pathol. 2012 Sep-Dec; 16(3): 400–405.
Fomaldehyde fixation. Fox CH, Hohnson FB, Whiting, The journal of histochemistry and cytochemistry. Vol 33, No. 8, pp. 845-854, 1985
To fix, To Harden, To preserve- fixation: A Brief History. M, Lamar Jones. Journal of Histotechnology. Vol 24, 2001, Issue 3
Formalin use in anatomical and histological science in the 19th and 20th centuries Agata Musiał1 , Ryszard W. Gryglewski2 , Stanislas Kielczewski1 , Marios Loukas3 , Justyna Wajda. Folia medica cracoviensia. Vo. LVI, 2, 2016:31-40
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28275269/
Analysis of DNA Sequences in Forty-Year-Old Paraffin-embedded Thin-Tissue Sections: A Bridge between Molecular Biology and Classical Histology. Shibata D, John Martin W, and Arnheim N. Cancer Res. 1988 Aug 15; 48(16):4564-6.
Can Archival Tissue Reveal Answers to Modern Research Questions?: Computer-Aided Histological Assessment of Neuroblastoma Tumours Collected over 60 Years. Chetcuti A , Mackie N, Tafavogh S, Graf N, Henwood T, Charlton A and Catchpoole D. Microarrays (Basel). 2014 Feb 28; 3(1):72-88.
Sites da Internet: